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1.清洗填料：取Anti-ACK-agarose100μL, 用1mL的PBSt洗（用移液槍將填料吹勻）3000轉(zhuǎn)/分離心去上清，重復(fù)3次，再用1mL 的PBS洗1次離心去上清。
2.與抗原結(jié)合：加100μL的ACK-OV（1mg/mL），4度放置30min，用1mL 的PBST洗（用移液槍將填料吹勻）3000轉(zhuǎn)/分離心去上清，重復(fù)2次。
3.洗脫抗原：加40μL0.1M HCl混勻，在室溫靜置5min,得抗原洗脫液，加入60μL0.1M Na2CO3中和，混勻，加入100μL0.05M Na2CO3，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心，取上清包被。
4.稀釋上清液：取50μL的上清液稀釋于100μL0.05M Na2CO3,即上清液稀釋3倍，抗原洗脫液稀釋了15倍。
5.包被：取一條酶標條，每孔先加入100μL0.05M Na2CO3,在第一孔加入100μL稀釋后的上清液，然后按2倍系列稀釋，依次得出抗原洗脫液稀釋度分別為1/30,1/60，1/120，1/240,1/480, 1/960, 1/1920,最后1孔設(shè)空白，37度靜置1h，
6.用PBSt洗酶標條3次，每次拍凈。
7.用1%的BSA37℃封閉30min；用PBSt洗酶標條3次，每次拍凈。
8.ACK-HRP用0.1%的BSA+PBST+0.1%HRP穩(wěn)定劑稀釋后，每孔加100μL,彈勻，37度反應(yīng)30分鐘，PBST洗4次，每孔加100μLTMB顯色5-10分鐘，每孔加100μL，2M硫酸終止，在450nm讀數(shù)，滴度大于1/500為合格。
