一 SDS-PAGE電泳（跑膠：蛋白質(zhì)分離）

1 制膠：

按配方配制凝膠。根據(jù)分子量大小選擇合適濃度的分離膠：5-7%的分離膠可轉(zhuǎn)移29-150kda, 8-10%用于小于14-66kda，18-20%用于小于20kDa的SDS變性蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移效率約100%。

灌分離膠：

兩塊板約需15mL。裝好凝膠灌膠裝置，加入蒸餾水放置5分鐘，檢查是否漏水。不漏，倒去水，滴干，開(kāi)始灌膠。

戴上手套（因聚丙烯酰胺Acrylamide，過(guò)硫酸銨，TEMED試劑有毒），按組分別在燒杯中加入各種試劑（上述三種存于冰箱，TEMED為促凝劑），用注射器（加樣器）混勻，然后將分離膠液體從頂部沿側(cè)邊注入，液面超過(guò)中間分隔板些許，加完雙面后左右晃動(dòng)一下，使液面平整。在沿邊壁輕放入90%異丙醇，讓凝膠靜置30min以上。倒去90%異丙醇，用雙蒸餾水洗滌2-3次，剪下小濾紙吸干夾層中的水，再灌濃縮膠。

通常不能形成整齊凝膠的原因是過(guò)硫酸銨或TEMED有問(wèn)題或兩者都有問(wèn)題。

灌濃縮膠：

兩塊板約需5mL,按組分在燒杯中加入各種試劑（上述三種存于冰箱，TEMED為促凝劑），用注射器（加樣器）混勻，然后將濃縮膠液體從頂部沿側(cè)邊注入，液面幾乎充滿夾層，插入梳子膠全部充滿夾層，室溫靜置40min以上。

保薦備用：用保鮮膜將整個(gè)裝置密封，置冰箱4℃保存，可在一周內(nèi)使用。

2 加電極液及加樣：

選取合適濃度的已灌膠（上層為積層膠即濃縮膠，下層為分離膠）的電泳裝置，取下玻璃平板夾層，小心拔出teflon梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔（碰歪可用最小bir頭或針拔正）。重新放入電泳槽內(nèi)（注意：玻璃夾板凹面向里，灌膠時(shí)向外），先往加樣槽內(nèi)加滿1×SDS電極緩沖液，然后小心往加樣孔加樣，加樣量見(jiàn)免疫印跡試驗(yàn)記錄表，加完樣后，在電泳裝置內(nèi)槽加入1×SDS電極緩沖液，使液面高于夾板凹面接近最高面，并且外槽也要加電極液（上次的內(nèi)槽電極液：重復(fù)利用）。

3 電泳：

加完樣（加樣量以每孔30-50μg為準(zhǔn)）后裝上電極（裝置外用冰袋降溫）開(kāi)始電泳（蛋白質(zhì)分離）：先設(shè)定80v電壓電泳，當(dāng)指示劑（溴酚藍(lán)）泳動(dòng)到分離膠界面（蛋白質(zhì)通過(guò)濃縮膠層）時(shí)約40min，待指示劑（溴酚藍(lán)）接近分離膠底時(shí)（約需2h）電泳結(jié)束。

電泳為恒壓電泳。

二 膜轉(zhuǎn)移（半干轉(zhuǎn)移）：

1 切膠：

戴上乳膠手套（進(jìn)行接觸濾紙，凝膠和膜的操作時(shí)，應(yīng)戴手套，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印），取下電泳玻璃夾板，小心分開(kāi)夾板，把濃縮膠用分離膠多余部分切除，按膠的尺寸大小再剪取硝酸纖維素膜（NC膜）二張用八張濾紙（可先剪好）

2 泡膠： 將上述切好的凝膠塊，NC膜，濾紙?jiān)诎敫呻娹D(zhuǎn)緩沖液中浸泡15分鐘。

3 裝槽： 在半干轉(zhuǎn)移的支持墊上按雙層濾紙→分離膠→NC膜→雙層濾紙的順序疊放，用濕玻棒輕輕滾過(guò)，排盡氣泡（各層之間不能有氣泡），凝膠靠近負(fù)極，而NC膜靠近正極。

4 半干轉(zhuǎn)移：

蓋上半干轉(zhuǎn)移槽蓋，夾緊，插上電極電源，設(shè)定電流100mA,轉(zhuǎn)移約35min, (分子量越大，時(shí)間越久，也可150mA，30min,大分子量，電流調(diào)大轉(zhuǎn)移快些，小分子量，電流調(diào)大，易轉(zhuǎn)移過(guò)頭)。整個(gè)轉(zhuǎn)移槽組合順序?yàn)椋贺?fù)極→支持墊→濾紙→分離膠→NC膜→濾紙→支持墊→正極。

5 洗膜：

轉(zhuǎn)移完畢，先用蒸餾水沖洗，再將NC膜放放已盛有TBST(TBS+0.05%的吐溫)的培養(yǎng)皿中在搖床約4min。

6 做好標(biāo)記：

根據(jù)多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物溶液（混MK）在NC膜上顯示的藍(lán)色帶在膜上壓出壓痕—即混合M的分子量的標(biāo)線：96kd,70kd,45kd,32kd,18kd。

7 封閉：

在培養(yǎng)皿中加入適量體積10-15mL的含5%的脫脂奶粉的TBST（或含3%BSA，或用TBST與豬血清1：1溶液），放入NC膜，室溫下?lián)u動(dòng)封閉30分鐘以上，用膠膜蓋好培養(yǎng)皿，置膠膜蓋好培養(yǎng)皿，置冰箱中過(guò)夜（主要是接著做時(shí)間不夠）。

8 上一抗：

將NC膜TBST洗滌搖洗3次，每次5分鐘。

取培養(yǎng)皿10個(gè)，編號(hào)：11#，12#，13#，14#，15#，21#，22#，23#，24#，25#（11#，21#分別表示第一，二塊大膜的第一，二塊大膜的第一，二小塊….）。在每個(gè)皿放2mL含0.5%的脫脂奶粉（或含0.1%BSA）的TBST溶液，按編號(hào)按濃度（見(jiàn)記錄表）要求加入一抗，在搖床上先10-20分鐘，再將NC膜剪開(kāi)按編號(hào)加入皿中，于室溫在搖床上雜交2小時(shí)。

9 洗滌：

用TBST洗滌NC膜4次，每次10分鐘

10 上二抗：

用試管將二抗（全部用羊抗兔IgG-HRP：因上述213，213-P，214，214-P均為由兔血生產(chǎn)的抗體）按1：5000（10μLIgG加TBST50mL）用含0.1%BSA的TBST溶液稀釋到50mL,每個(gè)皿放入5mL,放入NC膜（為節(jié)省IgG,可全部集中一個(gè)稍大的培養(yǎng)皿中，加20mL含0.1%BSA的TBST溶液）于室溫在搖床上雜交1小時(shí)。

11 洗滌：

用TBST洗滌NC膜4次，每次10分鐘

12 準(zhǔn)備顯色：

準(zhǔn)備好剪刀一把，鑷子一把，X膠片，適量顯影液，適量顯影液，適量定影液，TIP頭和相應(yīng)的移液槍，暗盒，透明塑料片。

上發(fā)光液： 將膜按編號(hào)順次排在硬塑料夾中，按1：1配制好ECL發(fā)光液各500μL，在暗房?jī)?nèi)將配好的發(fā)光液ECL1mL滴到NC膜上，并確保發(fā)光液均勻布在膜上，反應(yīng)3-5分鐘。

曝光：關(guān)照明燈，迅速取出合適膠片壓在NC膜隔一層薄膜上（注意位置），蓋緊暗盒，曝光1-10分鐘（視具體情況定）

顯影：轉(zhuǎn)移到顯影液中，輕輕晃動(dòng)使顯影均勻，直到能看見(jiàn)見(jiàn)黑色的條帶（約10-15秒）

定影：迅速將X膠片過(guò)一次蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到定影液中，輕輕晃動(dòng)定影液定影。

沖洗：用自來(lái)水將經(jīng)過(guò)定影處理的X膠片洗凈，晾干，記錄，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。